Vektordesign
Der Begriff Vektordesign bezeichnet in der Gentechnik die gezielte Anpassung eines Vektors (im allgemeinen Sinn) mit molekularbiologischen Methoden zur VervielfĂ€ltigung von DNA. So wurde schon 1977 das Plasmid pBR322 aus einem natĂŒrlich vorkommenden Plasmid entwickelt. In der Folge wurde dieses und andere Plasmide im Zuge des Vektordesigns verkleinert und mit neuen Antibiotikaresistenzen und ReplikationsursprĂŒngen versehen. Der am hĂ€ufigsten modifizierte Abschnitt umfasst die Klonierungsstelle, hĂ€ufig ein Bereich in dem viele nur einmal im Plasmid vorkommende (unique) Restriktionsenzym-Erkennungsstellen liegen, der multiplen Klonierungsstelle (mcs, multiple cloning site), auch Polylinker genannt. Sie dient dem gezielten Einbau von DNA MolekĂŒlen, mit dem Ziel der VervielfĂ€ltigung (Amplifikation) von Fremd-DNA. Zur Erzeugung rekombinanter Proteine, codierender oder nichtcodierender RibonukleinsĂ€uren und ihrer in vitro oder in vivo Anwendung werden geeignete flankierende Regulationsstellen inseriert. Dies erfolgt beispielsweise zu transienten Zwecken wie bei Impfstoffen (z. B. transiente virale Vektoren oder DNA-Impfstoffe), der transienten Transfektion oder bei onkolytischen Viren sowie zu permanenten Zwecken wie der Gentherapie oder der Erzeugung von gentechnisch verĂ€nderten Organismen.
Der Organismus oder Zelltyp bei der Herstellung ist nicht notwendigerweise auch der Zielorganismus des Vektors (engl. shuttle vector âPendelvektorâ, z. B. Plasmide mit eukaryotischen Expressionskassetten, virale Vektoren zur Verpackung in Zellkulturen). Oftmals werden daher Anpassungen an beide Arten von Wirten vorgenommen.
Verfahren und Effekte
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]Zur Steigerung der Genexpression werden auch die DNA-Abschnitte auĂerhalb der proteincodierenden Sequenz verĂ€ndert. Die Wahl des Promotors, Enhancers und Terminators kann die Expressionsmenge steigern,[1][2] sofern sie in der zur Proteinexpression eingesetzten Spezies verwendet werden können. Dabei gibt es deutliche Unterschiede zwischen SĂ€ugern, Bakterien und Archaeen.[3][4][5] Ebenso richtet sich das Vektordesign nach der Verwendung als Klonierungsvektor oder als Expressionsvektor.
Kernexportsequenzen können bei Eukaryoten die RNA-Konzentration im Zytosol und somit die Expressionsmenge durch das dortige Ribosom erhöhen.[6] Weiterhin kann durch eine Kozak-Sequenz die Erkennung der mRNA am Ribosom verbessert werden.[7] Durch ein Polyadenylierungssignal sowie durch die Vermeidung von AUUUA-Sequenzen am 3'-Ende kann der vorzeitige Abbau der mRNA gemindert werden.[8] Die modulare Eigenschaft des Polylinkers kann durch eine Insertion oder Deletion einer Erkennungssequenz fĂŒr Restriktionsenzyme modifiziert werden. Gelegentlich werden modular austauschbare Expressionskassetten verwendet, die einen Austausch durch homologe Rekombination oder durch das RMCE-Kassettenaustauschverfahren erlauben. Bei einer Expression mehrerer Proteine können mehrere Vektoren, mehrere Operons in einem Vektor, IRES, Inteine oder 2A-Peptide verwendet werden.
Die Replikation eines Plasmidvektors kann durch EinfĂŒgen eines oder mehrerer ReplikationsursprĂŒnge und eventuell notwendiger Centromere auf mehrere Arten erweitert werden, wodurch bei Plasmiden eine lĂ€ngerfristige Expression erreicht werden kann, z. B. bei Plasmiden in SĂ€ugerzellen.
Die VerĂ€nderung der Protein-codierenden Sequenz wird meistens parallel zum Vektordesign durchgefĂŒhrt. Im Zuge eines Proteindesigns können z. B. durch eine Codon-Optimierung der Expressionskassette die Expressionsrate gesteigert oder andere Eigenschaften verĂ€ndert werden.[9]
Vektorsicherheit
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]Eine maĂgebliche Anforderung an einen Vektor ist die Sicherheit seiner Anwendung in Lebewesen, die in Bezug auf den Menschen durch die biologische Schutzstufe gekennzeichnet wird. Die Einteilung der Schutzstufe betrachtet die PathogenitĂ€t, welche unter anderem durch die Möglichkeit einer Replikation, einer permanenten VerĂ€nderung des Genoms (die Insertion begĂŒnstigt eine Tumorentstehung), sowie durch die InfektiositĂ€t und die Symptomatik bestimmt wird.
Zur Vermeidung einer ĂŒberschieĂenden Immunreaktion werden bei bakteriell erzeugten Vektoren herstellungsbedingte Pyrogene untersucht. Ebenso dĂŒrfen bei Plasmiden die Antibiotikum-Resistenz-vermittelnden Resistenzgene, welche bei der Herstellung zur Selektion verwendet werden, nicht auf die Mikroorganismen ĂŒbertragen werden (z. B. Hautflora, Mundflora und Darmflora). Daher werden alternativ Auxotrophien zur Selektion der transgenen Organismen verwendet oder die Resistenzgene nachtrĂ€glich entfernt.
Bei viralen Vektoren werden einige zur Replikation notwendige Gene per Deletion entfernt, so dass eine Erzeugung nur durch Komplementation in einer Zelllinie erfolgen kann, die diese Gene zuvor erhalten hat. Dies wird als Replikationsdefizienz bezeichnet. Ebenso kann durch eine VerÀnderung des Rezeptors der Tropismus im Zuge einer Pseudotypisierung eingeschrÀnkt oder geÀndert werden. Durch die Verwendung Zelltyp-spezifischer Promotoren kann eine lokale Eingrenzung der Genexpression erreicht werden.
Vor der Entwicklung gentechnischer Methoden wurde eine Erhöhung der Sicherheit eines Virus durch Attenuierung erreicht. Diese Lebendimpfstoffe umfassen z. B. die Schluckimpfung gegen Poliomyelitis oder die auf dem Vacciniavirus basierenden Pockenimpfstoffe, MVA und NYVAC.
Literatur
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]- Cornel MĂŒlhardt: Der Experimentator: Molekularbiologie/Genomics. 6. Auflage. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2008, ISBN 978-3-8274-2036-7.
- Friedrich Lottspeich, Haralabos Zorbas: Bioanalytik. Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 1998. ISBN 3-8274-0041-4.
- Hubert Rehm, Thomas Letzel: Der Experimentator: Proteinbiochemie / Proteomics. 6. Auflage, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg 2009. ISBN 978-3-8274-2312-2.
Einzelnachweise
[Bearbeiten | Quelltext bearbeiten]- â J. Y. Qin, L. Zhang, K. L. Clift, I. Hulur, A. P. Xiang, B. Z. Ren, B. T. Lahn: Systematic comparison of constitutive promoters and the doxycycline-inducible promoter. In: PLOS ONE. 2010, Band 5, Nr. 5, Artikel e10611, PMID 20485554, PMCÂ 2868906 (freier Volltext).
- â J. Blazeck, H. S. Alper: Promoter engineering: Recent advances in controlling transcription at the most fundamental level. In: Biotechnology Journal. 2012, doi:10.1002/biot.201200120, PMID 22890821.
- â Z. L. Xu, H. Mizuguchi, A. Ishii-Watabe, E. Uchida, T. Mayumi, T. Hayakawa: Strength evaluation of transcriptional regulatory elements for transgene expression by adenovirus vector. In: Journal of Controlled Release. 2002, Band 81, Nr. 1-2, S. 155â63, PMID 11992688.
- â J. C. Samuelson: Recent developments in difficult protein expression: a guide to E. coli strains, promoters, and relevant host mutations. In: Methods in Molecular Biology. 2011, Band 705, S. 195â209, PMID 21125387.
- â S. Berkner, G. Lipps: Genetic tools for Sulfolobus spp.: vectors and first applications. In: Archives of Microbiology. 2008, Band 190, Nr. 3, S. 217â30, PMID 18542925.
- â J. E. Donello, J. E. Loeb, T. J. Hope: Woodchuck hepatitis virus contains a tripartite posttranscriptional regulatory element. In: Journal of Virology. 1998, Band 72, Nr. 6, S. 5085â92, PMID 9573279, PMCÂ 110072 (freier Volltext).
- â M. Kozak: An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs. In: Nucleic Acids Research. 1987, Band 15, Nr. 20, S. 8125â48, PMID 3313277, PMCÂ 306349 (freier Volltext).
- â T. Hamilton, M. Novotny, P. J. Jr. Pavicic, T. Herjan, J. Hartupee, D. Sun, C. Zhao, S. Datta: Diversity in post-transcriptional control of neutrophil chemoattractant cytokine gene expression. In: Cytokine. 2010, Band 52, Nr. 1-2, S. 116â22, PMID 20430641, PMCÂ 2919655 (freier Volltext).
- â E. Kotsopoulou, V. N. Kim, A. J. Kingsman, S. M. Kingsman, K. A. Mitrophanous: A Rev-independent human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1)-based vector that exploits a codon-optimized HIV-1 gag-pol gene. In: Journal of Virology. 2000, Band 74, Nr. 10, S. 4839â4852, PMID 10775623, PMCÂ 112007 (freier Volltext).
