从零开始：小鼠Bulk RNA-seq全流程实战指南

最新推荐文章于 2026-07-08 11:35:01 发布

原创

最新推荐文章于 2026-07-08 11:35:01 发布 · 684 阅读

1. 为什么你需要这份小鼠RNA-seq实战指南？

如果你刚接触生物信息学，或者正在为实验室的小鼠RNA-seq数据发愁，感觉那些流程和代码像天书一样，那你来对地方了。我刚开始做分析的时候，也经历过同样的迷茫，面对一堆看不懂的.fastq.gz文件和满屏的命令行，感觉无从下手。但别担心，Bulk RNA-seq分析其实是一套非常标准化的“流水线”作业，只要跟着步骤走，小白也能跑出漂亮的结果。

简单来说，Bulk RNA-seq就是一次性测量一个组织或一群细胞里所有基因的表达水平。比如，你想知道正常小鼠和患病小鼠的肝脏在基因表达上有什么不同，Bulk RNA-seq就是你的“显微镜”。它能帮你找到成百上千个表达量发生变化的基因，从而揭示疾病背后的分子机制。整个流程可以拆解成两大块：上游分析和下游分析。上游分析是“脏活累活”，主要跟原始测序数据打交道，包括下载、检查质量、清洗、比对到参考基因组、最后数出每个基因有多少个“读数”。这个过程通常在Linux服务器上用命令行完成。下游分析则是“艺术创作”，我们把上游得到的基因计数矩阵导入R语言，进行统计检验、找出差异基因，并用各种酷炫的图表把结果展示出来。

这份指南就是为你量身定做的。我会假设你只有最基础的计算机知识，手把手带你走完全程。你不用死记硬背每个命令，关键是理解每一步在做什么，以及为什么这么做。我会分享我踩过的坑和验证过的技巧，确保你不仅能复现，还能真正理解。好了，话不多说，我们直接从搭建分析环境开始。

2. 搭建你的分析“厨房”：软件与环境准备

做数据分析就像下厨，你得先把厨房收拾好，锅碗瓢盆（软件工具）备齐。我们不需要一个超级计算机，一台普通的Linux服务器或者Mac电脑就足够了。如果你用Windows，我强烈建议安装一个WSL2（Windows Subsystem for Linux），它能让你在Windows里拥有一个完整的Linux终端，非常方便。

2.1 安装核心软件包

首先，我们通过包管理器来安装大部分工具。打开你的终端，依次执行下面的命令。别被这一长串吓到，其实就是告诉系统：“把这些软件给我装上”。

# 更新软件源，确保能下载到最新版本
sudo apt update

# 安装上游分析的核心工具
sudo apt install -y fastqc hisat2 cutadapt subread samtools

# 安装Conda（如果你还没有的话）。这是一个强大的环境管理工具。
# 去Miniconda官网（https://docs.conda.io/en/latest/miniconda.html）下载Linux安装脚本，然后运行：
# bash Miniconda3-latest-Linux-x86_64.sh
# 安装时一路回车，最后重启终端。

# 使用Conda安装其他工具。Conda的好处是能自动解决软件依赖，避免版本冲突。
conda install -c bioconda -y multiqc trim-galore

我来解释一下这几个“厨具”是干嘛的：

FastQC：质检员。拿到测序数据（fastq文件）后，先用它快速看一眼数据质量怎么样，比如有没有接头污染、碱基质量如何。
Trim Galore：清洁工。它基于cutadapt，能自动识别并剪掉测序数据中的接头序列，并过滤掉低质量的读段。比单纯用cutadapt更智能。
HISAT2：地图导航员。它的任务是把清洗后的测序读段，“定位”到小鼠的参考基因组上。我们选它是因为它速度快、内存占用少，对初学者友好。
Samtools： BAM文件操作员。HISAT2输出的比对结果是.sam格式，文本很大。Samtools能把它转换成压缩的.bam格式，还能进行排序、索引等操作，是后续处理的基础。
featureCounts (来自Subread包)：计数器。它根据基因注释文件，统计每个基因上成功比对了多少读段，最终生成我们需要的计数矩阵。
MultiQC：报告汇总员。当你有几十上百个样本时，一个个看FastQC报告会累死。MultiQC能把这些报告汇总成一个漂亮的HTML页面，一目了然。

2.2 准备“菜谱”和“食材”：参考基因组与数据

软件齐了，接下来需要“菜谱”（参考基因组和注释）和“食材”（你的测序数据）。

# 1. 创建清晰的项目文件夹结构，好的习惯从命名开始
mkdir -p project/{rawdata,cleandata,genome,annotation,bam,qc,results}
cd project

# 2. 下载小鼠参考基因组和注释文件。这里我们用GENCODE数据库的版本，比UCSC的更常用。
# 下载基因组序列（FASTA文件）
wget -P genome/ -c https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M29/GRCm39.genome.fa.gz
# 下载基因注释（GTF文件）
wget -P annotation/ -c https://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/gencode/Gencode_mouse/release_M29/gencode.vM29.annotation.gtf.gz

# 3. 解压它们
gzip -dk genome/GRCm39.genome.fa.gz
gzip -dk annotation/gencode.vM29.annotation.gtf.gz

注意：GENCODE的版本号（如M29）会更新，请根据你分析时的最新版本调整链接。使用一致的基因组和注释版本至关重要！

对于测序数据，假设你的数据存放在NCBI的SRA数据库。原始文章提到了Aspera，但它需要配置密钥。对于新手，我更推荐用prefetch和fasterq-dump（来自sra-tools套件），虽然慢点但更稳定。

# 首先安装sra-tools
conda install -c bioconda sra-tools

# 假设你有SRA accession list（例如：SRR1374921, SRR1374922...）
# 创建一个文件 sra_list.txt，每行一个编号
# 然后使用循环下载并转换
while read sra; do
  prefetch $sra
  fasterq-dump --split-files $sra -O ./rawdata/
  # 如果是单端数据，--split-files可以不加；双端数据会生成两个文件
  gzip ./rawdata/${sra}*.fastq # 转换后压缩，节省空间
done < sra_list.txt

现在，你的rawdata文件夹里应该有了.fastq.gz格式的压缩测序文件。我们的“厨房”和“食材”都准备好了，可以开始烹饪了。

3. 上游分析：从原始数据到基因计数矩阵

上游分析是固定流程，我们一步步来，每一步我都会告诉你检查什么。

3.1 第一步：质控与数据清洗

测序仪产出的原始数据可能含有接头序列、低质量碱基，这些“杂质”会影响后续比对。所以先质检，再清洗。

# 第一步：用FastQC进行原始质量评估
for file in ./rawdata/*.fastq.gz; do
  fastqc $file -o ./qc/ --noextract --threads 4
done

# 第二步：用MultiQC汇总所有FastQC报告
multiqc ./qc/ -o ./qc/ -n rawdata_multiqc_report

打开生成的qc/rawdata_multiqc_report.html，重点关注：